喹諾酮類藥物殘留分析技術(shù)測(cè)定方法（一）

時(shí)間：2023-03-25 02:48:08來源：food欄目：食品快速檢測(cè) 閱讀：

喹諾酮類藥物殘留分析技術(shù)測(cè)定方法（一）

[db:作者] / 2022-12-19 00:00

11.1.4.2 測(cè)定方法

國(guó)內(nèi)外報(bào)道用于QNs殘留分析的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管電泳測(cè)定法(CE)等，也有報(bào)道用氣相色譜法(GC)、高效薄層色譜法(HPTLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)、免疫分析方法(IA)等方法。

(1)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)

HPLC是最常用的分離方法，通常使用C18/C8等色譜柱，但有些情況下也引入苯基或氨基鍵合的固定相。多數(shù)方法使用經(jīng)端基封閉處理的色譜柱甚或高純硅質(zhì)柱，防止由于色譜柱填料殘留的硅醇基(硅羥基)和金屬雜質(zhì)而導(dǎo)致的色譜峰拖尾。也可以在流動(dòng)相中加入季銨鹽、烷基硫酸鈉或烷基磺酸鈉等離子對(duì)試劑，它們可與質(zhì)子化的待測(cè)物以及三乙胺(TEA)或季銨鹽形成離子對(duì)，而TFA或季銨鹽可與待測(cè)物競(jìng)爭(zhēng)殘留的活性硅醇基，能夠獲得更好的保留、洗脫，和更大程度的分離效果。流動(dòng)相組成主要是乙腈-水，有時(shí)也使用乙腈-甲醇-水、乙腈-四氫呋喃(THF)-水或乙腈-二甲胺-水等，也有報(bào)道使用乙腈-甲醇-四氫呋喃-水四元溶劑體系，少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道有使用甲醇-水為流動(dòng)相。多殘留分析常采用梯度洗脫方法，為改善峰形常在流動(dòng)相中加入掃尾劑，可以減少硅醇基的電離，加入四氫呋喃(THF)，也可以減少拖尾峰。磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、草酸緩沖液等經(jīng)常用于將流動(dòng)相控制pH2～4，可以降低其與QNs陽離子之間的相互影響，獲得較好的分離。

HPLC常用的檢測(cè)器包括紫外檢測(cè)器(ultraviolet detector，UVD)、二極管陣列檢測(cè)器(diode-array detector，DAD)、熒光檢測(cè)器(fluorescence detector，F(xiàn)LD)、電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(electrogenerated chemiluminescence detector，ECLD)，以及UVD和FLD聯(lián)用等。

1)熒光檢測(cè)器(FLD)

QNs分子的基本結(jié)構(gòu)屬于喹啉酮類或氮雜喹啉酮類，具有很好的熒光性，常使用FLD檢測(cè)器，但不同QNs的熒光光譜又相差較大。在使用熒光檢測(cè)法進(jìn)行QNs多殘留檢測(cè)時(shí)，可采用程序波長(zhǎng)檢測(cè)法，使每個(gè)分析物的檢測(cè)波長(zhǎng)處于其自身波長(zhǎng)范圍內(nèi)，提高檢測(cè)靈敏度和選擇性。

Rambla-Alegre等報(bào)道了采用HPLC-FLD程序熒光波長(zhǎng)檢測(cè)雞蛋和牛奶中的DAN、DIF、FLU和MAR的方法。程序熒光檢測(cè)波長(zhǎng):0～9.3min，λex=260nm，λem=366nm，檢測(cè)FLU；9.3～20min，λex=280nm，λem=450nm，檢測(cè)MAR、DAN和DIF。四種QNs的回收率為96%～113.7%，RSD小于10%，LOD和LOQ分別為0.03～1.8μg/kg和0.5～6μg/kg。Herra-Herrera等報(bào)道了采用HPLC-FLD檢測(cè)牛、綿羊和山羊奶中7種堿性QNs(FLE、CIP、LOM、DAN、ENR、SAR和DIF)的方法。樣品用三氯乙酸～甲醇提取，HLB固相萃取柱凈化，HPLC-FLD檢測(cè)，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為280nm和450nm。研究發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相中添加1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽(1-ethyl-3-methylimidazolium tetrafuoroborate，EMlm-BF4)色譜分離效果要優(yōu)于添加1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽(1-butyl-3-methylimidazolium tetrafuoroborate)，流動(dòng)相為含3mmol/L EMIm-BF4和10mmol/L乙酸銨的水溶液(乙酸調(diào)pH3.0)-乙腈(87+13，v/v)，在Nova-Pak C18(150mm×3.9mm，4um)色譜柱上分離，18min內(nèi)良好分離了7種QNs，且沒有干擾。在牛奶中QNs的回收率為94%～113%，LOD為0.5～6.8ug/L；在山羊奶中QNs的回收率為79%～～92%，LOD為0.6～7.7ug/L；在綿羊奶中QNs的回收率為73%～87%，LOD為0.6～8.1μg/L。Haritova等建立了HPLC-FLD法檢測(cè)禽類血清樣品中的QNs。反相色譜柱分離，CIP和ENR的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別設(shè)定在277nm和418nm，DIF為295nm和500nm，MAR為338nm和425nm。流動(dòng)相為乙腈和磷酸鹽緩沖液中，流速為1mL/min。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為10～1000ng/mL。ENR不干擾CIP、DIF和MAR的測(cè)定，用來作為DIF和MAR檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)。批間RSD為1.73%～13.21%，批內(nèi)RSD為1.11%～7.18%，平均回收率高于85%。Rambla-Alegre等還建立了檢測(cè)尿液中QNs的HPLC方法。樣品無需前處理，直接進(jìn)樣檢測(cè)。檢測(cè)CIP、LOM、OFL、LEV和莫西沙星(moxifloxacin)時(shí)，以0.15mo/L十二烷基硫酸鈉、12.5%丙醇和0.5%三乙胺(pH3.0)為流動(dòng)相，激發(fā)波長(zhǎng)為285nm，發(fā)射波長(zhǎng)為465nm；檢測(cè)LOM、OFL和moxifloxacin時(shí)，以0.05mol/L十二烷基硫酸鈉、2.5%丙醇和0.5%三乙胺(pH3.0)為流動(dòng)相，激發(fā)波長(zhǎng)為295nm，發(fā)射波長(zhǎng)為485nm。在5ng/mL、50ng/mL和500ng/mL 3個(gè)添加水平，方法回收率為84.3%～116.2%，RSD低于8.4%，5種QNs的LOD低于0.5ng/mL，LOQ為1ng/mL。

李存等建立了同時(shí)檢測(cè)動(dòng)物肌肉組織中9種QNs(MAR、OFL、LOM、CIP、DAN、ENR、SAR、OXO、FLU)和磺胺類藥物的HPLC-FLD檢測(cè)方法。動(dòng)物肌肉組織樣品用磷酸鹽緩沖液提取，HLB固相萃取柱凈化，洗脫液氮?dú)獯抵两?，磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，采用甲酸水溶液-乙腈體系作為流動(dòng)相，梯度洗脫，F(xiàn)LD測(cè)定。程序熒光檢測(cè)波長(zhǎng)：0～11min，λex=297nm，λem=515nm；11～25min，λex=280nm，λem=450nm；25～55min，λex=320nm，λem=-365nm。方法的線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.9987；平均回收率為70.6%～103.4%，RSD為1.2%～11.4%；QNs的LOD為0.04～0.4μg/kg。潘媛等建立了HPLC-FLD法檢測(cè)動(dòng)物源性食品中6種QNs的方法。魚、肉及肝臟等樣品需經(jīng)過乙腈-0.1mol/L KH2PO4緩沖液提取，乙腈飽和的正己烷洗滌去除油脂；蛋及乳制品樣品用正己烷飽和的乙腈提取，乙腈飽和的正己烷去脂。方法的回收率為82%～105%，RSD為40%～12%，NOR、CIP、SAR及DAN的LOD為5.0μg/kg，ENR、DIF為3.0μg/kg。Stoilova等建立了HPLC-FLD法同時(shí)測(cè)定6種動(dòng)物源基質(zhì)中9種常用QNs。該方法使用乙腈萃取，OasisHLB固相萃取柱凈化，以甲酸水溶液、甲醇和乙腈作為流動(dòng)相，C18色譜柱分離，梯度洗脫，多波長(zhǎng)激發(fā)/發(fā)射熒光檢測(cè)器分析。9種QNs的LOD和LOQ分別為3～50μg/kg和7.5～100μg/kg?；厥章蕿?7%～120%，其RSD小于30%。Takeda等建立了一種有效篩查多種動(dòng)物和水產(chǎn)品中QNsHPLC-FLD法。目標(biāo)分析物包括MAR、OFL、NOR、CIP、ENR、DAN、ORB、DIF、SAR、OXA、NAL和FLU。樣品包括10種不同的食物產(chǎn)品：肉(牛、豬和雞)、肝臟(雞)、生魚(蝦和鮭魚)、雞蛋和加工食品(火腿、香腸和魚香腸)。乙腈-甲醇(1+1，v/v)提取，經(jīng)帶有Fe3+的固相化金屬螯合親和柱凈化，以甲醇-水-甲酸(15+85+0.1，v/v)作為流動(dòng)相，反相色譜柱分離，F(xiàn)LD在不同激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)(OFL、NOR、CIP、ENR、DAN、ORB、DIF和SAR：295nm/455nm；MAR：295nm/495nm；OXA、NAL和FLU：320nm/365nm)，NOR/OFL，ORB/DIF和ENR/DAN不能完全分離。最佳條件下，日內(nèi)和日間回收率分別為88.5%(56.1%～108.6%)和78.7%(44.1%～99.5%)，RSD分別為7.2%(0.7%～18.4%)和6.8%(1.4%～16.6%)；LOQ為0.8μg/kg(DAN)-6.5μg/kg(SAR)。

2)紫外檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器(UVD/DAD/PDA)

有些QNs如PIR和MAR的自身熒光較弱，多采用UVD或DAD來測(cè)定。Tsai等建立了HPLC-DAD方法檢測(cè)豬肌肉組織中的SAR、DAN、NAL、OXO、ENR、FLU和哌啶。DLLME提取和凈化，流動(dòng)相為含有3.7mmol/L無水硫酸鎂和十二烷基硫酸鈉的乙腈-0.05mol/L NaH2PO4 (pH2.5)(35+65，v/v)，在Cosmosil 5C18-AR-II(5um，250mm×4.6mm)色譜柱上分離。方法回收率為93.0%～104.7%，LOD為5.6～23.8μg/kg。Bailac等建立了SPE-LC-UVD方法檢測(cè)雞組織中的7種QNs(CIP、DAN、ENR、SAR、DIF、OXO、FLU)。流動(dòng)相為乙腈-檸檬酸緩沖液(12+88，v/v)，方法比較不同色譜柱的分離效果，包括Kromasil C8柱(4.6mmi.d.×250mm)、Inertsil C8柱(4.6mmi.d.×250mm)、ZorbaxEclipseXDB-C8柱(4.6mmi.d.×150mm)、LichrospherC18柱(4.6mmi.d.×250mm)和Nucleosil C18柱(4.6mmi.d.×250mm)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用C18柱色譜峰會(huì)變寬，而C8色譜柱色譜峰會(huì)更好，Inertsil C8和ZorbaxEclipseXDB-C8可以使SAR和ENR達(dá)到基線分離，ZorbaxEclipse XDB-C8柱分離效果最好。OXO、FLU在250nm檢測(cè)，其他QNs在280nm檢測(cè)。方法回收率為58%～107%，LOD為10～30μg/kg。Evaggelopoulou等報(bào)道了HPLC-DAD法檢測(cè)魚和烏頰魚中7種QNs。PerfectsilODS-3(250mm×4mm，5um)的色譜柱進(jìn)行分離，梯度洗脫，流動(dòng)相為含0.1%三氟乙酸(pH1)的乙腈和甲醇，DAD在255nm下檢測(cè)酸性QNs(OXO、FLU和NAL)，275nm下檢測(cè)CIP、DAN、ENR和SAR。

3)紫外檢測(cè)器串聯(lián)熒光檢測(cè)器(UVD-FLD)

在色譜分析中還將UVD和FLD串聯(lián)使用，可實(shí)現(xiàn)熒光性QNs和非熒光性QNs的同步檢測(cè)。Marazuela等利用UVD和FLD串聯(lián)檢測(cè)牛奶中CIP、ENR、MAR、DAN和SAR殘留。其中MAR利用UVD在298nm檢測(cè)，其他QNs使用FLD檢測(cè)，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為280nm和440nm。流動(dòng)相為25mmol/L正磷酸溶液(NaOH調(diào)pH3.0)和乙腈，梯度洗脫，色譜柱為極性封端AQUATM C18柱(4.0mm×3.0mm，5um)。方法回收率為80%～103%，RSD低于6.6%，LOD為0.5～3ng/mL，LOQ為2.4～10ng/mL。

4) 電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(ECLD)

ECLD是對(duì)電極施加一定的電壓進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)，電極反應(yīng)產(chǎn)物之間或電極反應(yīng)產(chǎn)物與體系中某種組分之間進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光，通過測(cè)量發(fā)光光譜強(qiáng)度來測(cè)定物質(zhì)含量的一-種痕量分析方法，具有靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)便、易于控制，并且實(shí)驗(yàn)中的一些試劑可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)。Yao等在研究氟喹諾酮的電化學(xué)發(fā)光性質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在中性磷酸鹽緩沖溶液中，電位在0～1.8V范圍內(nèi)進(jìn)行掃描基本沒有電化學(xué)發(fā)光；同樣條件下，過硫酸根有較弱的電化學(xué)發(fā)光；但當(dāng)氟喹諾酮和過硫酸根同時(shí)存在時(shí)，同樣條件下進(jìn)行電位掃描可以產(chǎn)生非常強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，發(fā)光強(qiáng)度大概是單獨(dú)過硫酸根存在時(shí)的350倍。Sun等研究發(fā)現(xiàn)OFL在NaNO3溶液中可以直接產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，結(jié)合HPLC建立了一種簡(jiǎn)單靈敏的檢測(cè)血清中OFL含量的新方法。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，OFL檢測(cè)的線性范圍是1.0×10-8～4.0×10-6 g/mL，LOD是4×10-9 g/mL。

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