硝基咪唑類藥物殘留分析技術(shù)——凈化方法（一）

時(shí)間：2023-03-24 23:42:09來(lái)源：food欄目：食品快速檢測(cè) 閱讀：

硝基咪唑類藥物殘留分析技術(shù)——凈化方法（一）

[db:作者] / 2022-12-21 00:00

(2)凈化方法

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

LLP凈化是利用待測(cè)物與雜質(zhì)在互不相溶的兩相溶劑中溶解度和分配系數(shù)的差異進(jìn)行的凈化。待測(cè)物和雜質(zhì)之間如果有較大極性差異或隨著溶液系統(tǒng)pH的變化極性有明顯改變時(shí)，常選用LLP。LLP遵循相似相溶原則，選擇好兩相溶劑，充分利用水相pH的調(diào)節(jié)作用使待測(cè)物成游離離子態(tài)或結(jié)合成中性有機(jī)分子，以提高提取效率。本類藥物的堿性性質(zhì)常用作LLP凈化的基礎(chǔ)。在中性和堿性條件下，硝基咪唑類藥物呈分子狀態(tài)，易于由水相轉(zhuǎn)入有機(jī)相，清除水溶性雜質(zhì)；而在酸性條件下，藥物呈離子狀態(tài)，易于由有機(jī)相轉(zhuǎn)入水相，清除脂溶性雜質(zhì)。因此，硝基咪唑類藥物L(fēng)LP凈化中常通過(guò)調(diào)節(jié)溶劑酸堿性轉(zhuǎn)移藥物和清除雜質(zhì)。液液分配雖然操作方便，但也存在缺點(diǎn)，即需要大量有機(jī)溶劑進(jìn)行多次萃取，而且易乳化，影響回收率，特異性較差。

Shen等用乙酸乙酯提取豬組織中MNZ、DMZ、DMZOH和RNZ，提取液吹干后用稀鹽酸-正己烷L(zhǎng)LP去除脂溶性物質(zhì)，HPLC測(cè)定。LOD為1.0～2.0μg/kg；肌肉中的平均回收率為80.1%～83.9%，肝臟組織為78.9%～82.3%。高小龍測(cè)定雞組織(肌肉、肝臟、腎臟、脂肪)中MNZ和DMZ殘留，用二氯甲烷提取，吹干后，用水-正已烷L(zhǎng)LP脫脂，HPLC測(cè)定。DMZ及DMZOH的LOQ均為1μg/kg；肌肉中的平均回收率在56.9%～76.5%之間，肝臟在63.3%～72.6%之間，腎臟在64.2%～73.3%之間，脂肪在63.5%～75.7%；日內(nèi)CV均小于16%，日間CV均小于18%。Sorensen等用乙腈和正己烷提取魚(yú)肉中的MNZ和MNZOH，用正已烷脫脂，將殘留物轉(zhuǎn)移至乙腈相，HPLC測(cè)定。魚(yú)肌肉中2種藥物的LOD均為2.8μg/kg，魚(yú)皮中MNZ的LOD為3μg/kg，MNZOH為5μg/kg；MNZ絕對(duì)回收率為93%～81%，MNZOH為79%；CV分別為3.3%和3.2%。黎翠玉等測(cè)定豬肉、雞肉和魚(yú)肉中MNZ、DMZ和RNZ三種硝基咪唑類化合物及兩種代謝物MNZOH、HMMNI殘留。乙酸乙酯提取液蒸干后，用甲醇和正己烷L(zhǎng)LP除脂，LC-MS/MS測(cè)定?；厥章试?1.1%～108.0%之間，RSD為1.9%～6.3%，LOQ為0.1μg/kg。Gaugain等用二氯甲烷提取豬、禽組織中3種硝基咪唑類藥物，提取液蒸干，用乙酸銨緩沖液-正己烷L(zhǎng)LP脫脂，再用SPE凈化，高效薄層色譜(HPTLC)測(cè)定。RNZ、DMZ、DMZOH的LOD分別為2μg/kg、5μg/kg、5μg/kg。GB/T21318-2007測(cè)定動(dòng)物組織樣品中RNZ、IPZ、MNZ、DMZ、ORZ、4-硝基咪唑、CMNI、苯硝咪唑等8種硝基咪唑和2種代謝物MNZOH、HMMNI殘留。用飽和氯化鈉-甲醇-丙酮提取后，蒸干有機(jī)相，加入乙酸乙酯與氯化鈉溶液LLP凈化，LC-MS/MS測(cè)定。LOD為0.5～1μg/kg，回收率為71.4%～115%。

Cronly等測(cè)定禽蛋中MNZ、DMZ、RNZ、IPZ和羥基化代謝物MNZOH、HMMNI、IPZOH。禽蛋用乙腈提取，提取液用氯化鈉沉淀雜質(zhì)，用正已烷與乙腈LLP脫脂，LC-MS/MS測(cè)定。CCa為0.33～1.26μg/kg，CCβ為0.56～2.15μg/kg，回收率為87.2%～106.2%。

高小龍測(cè)定蜂蜜和蜂王漿中RNZ、MNZ、DMZ、ORZ和TNZ殘留。蜂王漿用鹽酸溶解，氯化鈉沉淀雜質(zhì)，正已烷去脂；蜂蜜樣品僅用鹽酸溶解稀釋，取上層酸液加磷酸氫二鉀15g，用二氯甲烷萃取，鹽酸反萃取，過(guò)SCX SPE柱，用0.5mol/L的磷酸氫二鉀溶液(pH8.8)洗脫，洗脫液再萃取至二氣甲烷，HPLC檢測(cè)。通過(guò)調(diào)節(jié)酸堿性，在水相和有機(jī)相多次轉(zhuǎn)移，達(dá)到凈化效果，缺點(diǎn)是較為繁瑣。蜂蜜和蜂王漿中RNZ、MNZ、DMZ、ORZ和TNZ的LOQ均為1.0μg/kg；平均回收率分別為59.2%～7.06%和54.9%～69.1%；CV小于18%和16%。

2)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

SPE是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品基質(zhì)和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的，其原理與液相色譜類似。與LLP相比，SPE具有使用有機(jī)溶劑較少，速度快，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，不會(huì)發(fā)生乳化，凈化后殘留的雜質(zhì)相對(duì)較少等優(yōu)點(diǎn)。硝基咪唑類藥物屬于中等極性，屬于堿性化合物，提取液中除分析物以外常含有很多共提物，為了除去這些干擾物，需要進(jìn)一步采用SPE凈化。在凈化中常用的SPE柱有C18、HLB、硅膠、SCX、MCX、Extrelut NT20和XTR等。

A.陽(yáng)離子交換柱

陽(yáng)離子SPE柱是本類藥物最常用的凈化工具，主要采用SCX和MCX柱。

SCX為強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱，質(zhì)子化的藥物分子通過(guò)與小柱.上苯磺酸基團(tuán)相互作用而被保留。SCX對(duì)硝基咪唑類藥物離子互作力遠(yuǎn)大于非極性互作力，允許強(qiáng)洗滌溶劑凈化。使用SCX柱，則要溶于酸性水相上樣，洗脫液選用5%氨水-乙腈溶液，或乙酸乙酯洗脫。Lin等測(cè)定豬肌肉中5種硝基咪唑類藥物，用SCX凈化。乙酸乙酯提取液蒸干后用乙酸-乙酸乙酯(1+19，v/v)復(fù)溶后上樣，依次用丙酮、甲醇、乙腈淋洗，最后用氨水-乙腈(1+19，v/v)洗脫，毛細(xì)管電泳(CE)檢測(cè)。LOD為0.3～1.0μg/kg，LOQ為0.9～3.2μg/kg；日內(nèi)回收率為85.4%～96.0%，CV為1.3%～3.9%；日間回收率為83.5%～92.5%，CV為1.1%～4.2%。Sun等用乙酸乙酯提取禽和豬肉中的MNZ、RNZ、DMZ、TNZ、ORZ、SNZ和DMZOH，提取液上scx柱凈化，依次用丙酮、甲醇、乙腈淋洗，用氨水-乙腈(5+95，v/v)洗脫。7種藥物的LOD為0.2μg/kg，回收率為71.4%～99.5%。Sams等測(cè)定禽蛋中硝基咪唑殘留。乙腈提取液用乙酸酸化后用SCX凈化，依次用丙酮、甲醇和乙腈淋洗，用乙腈-35%氨水(95+5，v/v)洗脫，HPLC測(cè)定。LOD為0.5μg/kg；禽蛋中回收率分別為65%(DMZ)、87%(RNZ)和75%(MNZOH)。高小龍采用HPLC測(cè)定蜂蜜和蜂王漿中的RNZ、MNZ、DMZ、ORZ和TNZ。樣品提取液經(jīng)鹽酸反萃取后，上SCX柱凈化，用3mL水淋洗，除去水溶性物質(zhì)，最后采用20mL pH8.8的0.5mol/L的磷酸鹽緩沖液洗脫。蜂蜜和蜂王漿中RNZ、MNZ、DMZ、ORZ和TNZ的LOQ均為1.0ug/kg，回收率為59.2%～70.06%和54.9%～69.1%，CV分別小于18%和16%。

MCX柱為反相與強(qiáng)陽(yáng)離子交換混合保留機(jī)制的SPE柱。Xia等用MCX柱凈化豬腎組織中4種硝基咪唑及其代謝物(MNZ、HMMNI、MNZOH、RNZ、IPZ、IPZOH、DMZ)的乙酸乙酯提取液。提取液蒸干后用鹽酸復(fù)溶，上MCX SPE小柱，依次用0.1mol/L鹽酸，甲醇和5%氨水淋洗，用含5%氨水的甲醇-水(70+30，v/v)洗脫。平均回收率為83%～111%，CV小于12%，LOD和LOQ分別為0.05～0.5μg/kg和0.1～0.5μg/kg。研究發(fā)現(xiàn)，改善凈化條件也可以降低基質(zhì)效應(yīng)，在MCX凈化中，洗滌步驟增加2%(v/v)氨水-10%(v/v)甲醇溶液，洗脫步驟增加2%(v/v)氨水-30%(v/v)甲醇溶液可明顯降低基質(zhì)效應(yīng)。王揚(yáng)等同時(shí)測(cè)定魚(yú)肌肉中MNZ、DMZ、ORZ、TNZ和RNZ等5種硝基咪唑類藥物殘留。提取液過(guò)MCX柱，3.0mL水洗柱，3.0mL 2%濃氨水甲醇溶液洗脫。5種硝基咪唑類藥物的LOD均為1.0μg/kg，回收率分別為73.3%、74.7%、62.9%、74.4%和80.1%，RSD不大于10%。

B.陰離子交換柱

陰離子交換SPE也有用于硝基咪唑類藥物凈化的報(bào)道。GB/T20744-2006測(cè)定蜂蜜中MNZ、DMZ和RNZ殘留，乙酸乙酯提取液濃縮后，過(guò)Carboxylic acid SPE柱凈化，依次用乙酸乙酯和乙腈洗滌，用甲醇-乙腈-0.1%甲酸溶液(40+18+42，v/v)洗脫。MNZ的LOD為0.1μg/kg，DMZ和RNZ為0.2μg/kg；回收率為69.5%～82.4%。

C.正相柱

用正相SPE柱凈化硝基咪唑類藥物也能起到良好效果。常用的填料主要有硅膠、氨基和硅藻土。Cannavan等建立了DMZ的殘留分析技術(shù)。肌肉用二氯甲烷提取，雞肝臟和禽蛋用甲苯提取，提取_上清液直接上硅膠柱凈化，二氯甲烷提取液用甲苯淋洗，甲苯提取液依次用二氯甲烷、正已烷淋洗，丙酮洗脫，液質(zhì)聯(lián)用儀分析。DMZ內(nèi)標(biāo)校正回收率為93%～102%，CV為1.2%～7.7%，絕對(duì)回收率約80%。Sakamoto等測(cè)定魚(yú)肉和蜂蜜中的DMZ、MNZ和RNZ，乙酸乙酯提取液蒸干后用乙酸乙酯-正己烷(3+7，v/v)復(fù)溶，用硅膠柱凈化，乙酸乙酯洗脫。平均回收率為91.21%～107.0%，CV為1.7%～17.1%，LOD為0.05～0.2μg/kg。Sorensen等將魚(yú)肉中MNZ和MNZOH的乙腈提取液蒸干后，復(fù)溶于乙酸乙酯-正己烷溶液(1+2，v/v)中，過(guò)硅膠小柱凈化，乙酸乙酯-正己烷(1+2，v/v)淋洗，甲醇-乙酸乙酯(1+9，v/v)洗脫。MNZ回收率為81%～93%，MNZOH回收率為79%。氨基柱與硅膠柱凈化機(jī)制相似，分別通過(guò)藥物的極性基團(tuán)與氨基或硅醇基相互作用達(dá)到保留，但組織中微量的水分對(duì)方法的精密度和重復(fù)性具有較大影響，因此在凈化前加入無(wú)水硫酸鈉脫水非常關(guān)鍵。Ho等用甲苯提取肌肉、肝臟和腎臟中的MNZ和DMZ，提取液用等體積正已烷稀釋后，上氨基固相萃取柱凈化，用正己烷淋洗，乙酸乙酯～異丙醇(9+1，v/v)洗脫，氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)測(cè)定?；厥章蕿?2%～106%，CV小于13%。DMZ的蒸汽壓較高，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和氮?dú)獯蹈蒁MZ隨溶劑揮發(fā)而損失，為防止吹干時(shí)DMZ被溶劑帶走，考察了DMF、甲酸、三氟乙酸等3種溶劑和蒸發(fā)溫度對(duì)DMZ的保護(hù)效果，表明加入保護(hù)劑三氟乙酸和二甲基甲酰胺或者蒸發(fā)溫度降低時(shí)，DMZ的回收率增高。三氟乙酸可做保護(hù)劑的可能原因時(shí)它與DMZ發(fā)生反應(yīng)生成較難揮發(fā)的鹽。Zhou等分析蜂蜜中的MNZ、RNZ、DMZ、TNZ和HMMNI，提取液蒸干后用乙酸乙酯-正己烷(2+1，v/v)復(fù)溶，氨基柱上加2g無(wú)水硫酸鈉用于脫水，上樣后直接用甲醇-乙酸乙酯(1+4，v/v)洗脫，洗脫液蒸干后用流動(dòng)相溶解測(cè)定。方法LOD為1～2μg/kg，平均回收率在71.5%～101.4%之間。研究還發(fā)現(xiàn)，上樣溶液中加入非極性溶劑-正已烷，可提高藥物與極性固定相的相互作用，增加凈化效果和回收率。

Extrelut NT20和XTR的填料是硅藻土(Celite顆粒)，屬于正相SPE柱，也可以用于本類藥物凈化。Polzer等應(yīng)用Extrelut NT20柱凈化畜禽肌肉提取液中的DMZ、RNZ、MNZ、IPZ、HMMNI、MNZOH和IPZOH。水溶液上樣后，用乙酸乙酯-叔丁基甲基醚(1+1，v/v)洗脫。DMZ、RNZ、HMMNI、MNZ和MNZOH的CCa為0.65～2.8μg/kg，IPZ和IPZOH的CCa為5.2～5.3μg/kg；回收率在96%～118%之間。該凈化的特點(diǎn)為，所有的脂溶性化合物從水溶液中提取出來(lái)進(jìn)入有機(jī)相，而水相則保留在固定相上，流出液無(wú)乳化，直接蒸發(fā)后用于下一步的分析。

D.反相柱

反相SPE也可以用于硝基咪唑類藥物凈化，常用的SPE柱有HLB和C18。

Mottier等測(cè)定雞肉和禽蛋中的硝基咪唑類藥物，乙腈提取液蒸干后用水復(fù)溶，上HLB柱，用3mL水-甲醇(95+5，v/v)淋洗，甲醇洗脫，LC-MS/MS測(cè)定。DMZ、RNZ、MNZ、IPZ、DMZOH、MNZOH和IPZOH的CCa在0.12～1.0μg/kg之間，CCβ在0.22～1.0μg/kg之間。Shen等用乙酸乙酯提取，蒸干后用鹽酸溶解，與正己烷L(zhǎng)LP脫脂，鹽酸溶液上HLB柱凈化，甲醇洗脫，HPLC測(cè)定。DMZOH、MNZ、RNZ和DMZ的LOD在1.0～2.0μg/kg之間；豬肉的平均回收率為80.1%～83.9%，豬肝為78.9%～82.3%。

高小龍建立了測(cè)定雞可食組織中DMZ和DMZOH殘留的HPLC法。雞組織(肌肉、肝臟、腎臟、脂肪)勻漿后，用無(wú)水硫酸鈉和二氯甲烷振蕩提取，取有機(jī)層濃縮，加水溶解，用正己烷去脂，水層過(guò)C18柱，甲醇洗脫，HPLC在320nm檢測(cè)。DMZ和DMZOH的LOQ均為1μg/kg；肌肉的平均回收率在56.9%～76.5%之間，肝臟在63.3%～72.6%之間，腎臟在64.2%～73.3%之間，脂肪在63.5%～75.7%；日內(nèi)CV均小于16%，日間CV均小于18%。Gaugain等用C18 SPE凈化豬、禽組織中3種硝基咪唑類藥物，用5mL乙酸銨緩沖液淋洗，用2mL乙酸銨緩沖液-甲醇(1+3，v/v)洗脫，HPTLC測(cè)定。RNZ、DMZ、DMZOH的LOD分別為2μg/kg、5μg/kg、5μg/kg。

3)凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography，GPC)

GPC是基于體積排阻的分離機(jī)理，通過(guò)具有分子篩性質(zhì)的固定相，相對(duì)分子質(zhì)量大的組分先流出(即淋洗時(shí)間短)，相對(duì)分子質(zhì)量小的后流出(即淋洗時(shí)間長(zhǎng))，達(dá)到凈化目的。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T21318-2007測(cè)定豬肉、雞肉、牛肉、豬肝、雞肝、牛肝、豬腎、牛腎和魚(yú)肉中4-硝基咪唑、IPZ、MNZ、RNZ、MNZ、CMNI、DMZ、苯硝咪唑及其代謝物MNZOH、HMMNI殘留時(shí)，取5mL提取液用GPC進(jìn)行凈化。凈化柱為GPC Bio Beads SX3(700mm×25mm)，流動(dòng)相為乙酸乙酯～環(huán)已烷(1+1，v/v)，流速為4.7mL/min，棄去先留出90mL淋洗液，再收集接下來(lái)90mL流出液，最后再用30mL收集，蒸干后，用甲醇溶解再進(jìn)一步用C18小柱凈化，LC-MS/MS測(cè)定。方法LOD在0.5～1μg/kg之間，回收率為71.4%～115%。

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