阿維菌素類藥物殘留測(cè)定方法（二）

時(shí)間：2023-03-24 21:01:41來(lái)源：food欄目：食品快速檢測(cè) 閱讀：

阿維菌素類藥物殘留測(cè)定方法（二）

[db:作者] / 2022-12-26 00:00

(3)高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)

AVMs屬于低極性化合物，利用反相-高效液相色譜(RP-HPLC)能獲得較好的選擇性。在AVMs殘留分析中采用HPLC的方法報(bào)道較多，主要利用紫外檢測(cè)器(UVD)、二極管陣列檢測(cè)器(PDADAD)和熒光檢測(cè)器(FLD)測(cè)定。

1)紫外檢測(cè)器(UVD)

AVMs的共軛二烯結(jié)構(gòu)在240～250nm處有強(qiáng)烈的紫外吸收，利用此特點(diǎn)，可建立紫外檢測(cè)法，但在此光譜區(qū)域存在著皮質(zhì)激素、維生素、脂類、核酸等眾多內(nèi)源性物質(zhì)，會(huì)嚴(yán)重干擾檢測(cè)。另外，AVMs在體內(nèi)的最小有效濃度很低，如IVM在血漿中的最小有效濃度為0.5～1.0ng/mL，而在報(bào)道的HPLC-UVD方法中，靈敏度-般很難低于2ug/kg，難以滿足分析要求。因此，采用UVD測(cè)定的方法并不多。

曹紅等建立了HPLC-UVD法測(cè)定綿羊血漿中AVM的殘留量。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取后直接進(jìn)HPLC測(cè)定。分離色譜柱為SHIMPAVKCLC-ODS柱，乙腈-含0.1%磷酸的磷酸二氫鉀緩沖液(65+35，v/v)為流動(dòng)相，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)245nm。該方法LOD為4ng/mL。Massarollo等報(bào)道了采用HPLC-UVD檢測(cè)蜂蜜中AVM的殘留分析方法。樣品經(jīng)LLE提取，SPE凈化后，進(jìn)RP-HPLC測(cè)定。以乙腈-甲醇-水為流動(dòng)相，245nm檢測(cè)。方法LOD和LOQ分別為0.002mg/kg和0.007mg/kg，回收率在73.4%～97.45%之間，RSD為0.91%～13.7%。Li等建立了豬肝中IVM的HPLCUVD測(cè)定方法。樣品用甲醇提取，經(jīng)IAC柱凈化后進(jìn)RP-HPLC檢測(cè)，UVD在245nm下定量。方法LOD為2ug/kg，回收率在85%～102%之間，CV為6%～12%。Garcia-Mayor等報(bào)道了采用HPLC檢測(cè)羊奶中IVM的殘留分析方法。樣品經(jīng)MSPD技術(shù)處理后，進(jìn)HPLC檢測(cè)。色譜柱為Hypersil ODS柱(5um，250mm×4.6mm)，柱溫60℃，25mmol/L KH2PO4(pH7)和乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1.2mL/min，在245nm檢測(cè)。該方法回收率為74%～97%，RSD在1.6%～9.0%之間。

2)二極管陣列檢測(cè)器(PDA/DAD)

二極管陣列檢測(cè)器(PDADAD)能實(shí)現(xiàn)對(duì)流出的色譜峰進(jìn)行瞬間的全光譜掃描，同時(shí)得到色譜峰保留值、純度和吸收光譜方面的信息。由于AVMs殘留的確證方法一般比較復(fù)雜，當(dāng)樣品中藥物殘留水平較高時(shí)，PDADAD可以成為一種選擇。通過(guò)對(duì)峰保留時(shí)間、吸收光譜形狀與標(biāo)準(zhǔn)品的相似性，做出初步確證。Campillo等報(bào)道了檢測(cè)奶中AVM、IVM、DOR、EPR和MOX的HPLC分析方法。樣品經(jīng)DLLME技術(shù)提取后，用HPLC-DAD檢測(cè)，基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，方法LOQ在1.0～4.7ng/g之間。

3)熒光檢測(cè)器(FLD)

由于AVMs本身沒(méi)有對(duì)稱共軛結(jié)構(gòu)，不能直接用FLD檢測(cè)，只有經(jīng)衍生化后，生成具有對(duì)稱共軛的苯環(huán)結(jié)構(gòu)才能發(fā)射熒光，故選擇適宜的熒光衍生化試劑及反應(yīng)條件顯得非常重要。AVMs的熒光衍生一般遵循酰化、脫水然后成芳香環(huán)的機(jī)制(圖21-1)，但熒光衍生物存在不穩(wěn)定性的問(wèn)題尚有待解決。FLD使檢測(cè)的選擇性和靈敏度顯著提高，靈敏度較UVD約低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，可滿足AVMs殘留分析的要求。

圖21-1 AVM的熒光衍生機(jī)制

Tolan等建立了血漿中IVM的分析方法。干燥后的提取物使用吡啶做催化劑，以醋酸酐為脫水劑，在105～110℃反應(yīng)22～24h，熒光衍生反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱凈化后，用RP-HPLC-FLD測(cè)定。激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為364nm和480nm，方法的LOD為0.5μg/kg，RSD小于8%。Tway等報(bào)道了牛羊肝臟、脂肪和肌肉組織中IVM的HPLC-FLD測(cè)定方法。提取物在90℃溫度下，用強(qiáng)親核催化劑(N-甲基咪唑)和溶劑DMF衍生化反應(yīng)1h，衍生產(chǎn)物進(jìn)HPLC分析。方法回收率為83%，LOD可達(dá)1～2μg/kg。Norlander等檢測(cè)豬肝臟中的IVM，采用類似的衍生化方法和FLD檢測(cè)條件，方法平均回收率為87%，LOD為0.5～1μg/kg。De Montigny等采用強(qiáng)?；瘎┤姿狒?TFAA)代替醋酸酐，以乙腈做溶劑，反應(yīng)條件和操作步驟簡(jiǎn)單快速，不需要進(jìn)一步的凈化步驟。將動(dòng)物血漿提取物中的溶劑吹干，加入100μL TFAA-乙腈(1+2，v/v)溶解殘留物，再加入150uL N-甲基咪唑-乙腈(1+1，v/v)后，立即密閉(產(chǎn)生大量白霧并放熱)，待白霧消失后，反應(yīng)溶液可直接HPLC-FLD測(cè)定。該方法IVM的LOD可達(dá)到20pg/mL，同時(shí)衍生副產(chǎn)物減少。Rabel等用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(LIFD)測(cè)定血漿中IVM殘留。窄徑HPLC梯度洗脫與傳統(tǒng)的熒光檢測(cè)對(duì)血漿中IVM的LOQ為0.01ng/mL左右，而等度色譜條件與LIFD結(jié)合也能夠達(dá)到0.01ng/mL的靈敏度。同時(shí)，自動(dòng)衍生化進(jìn)樣操作可以減少手動(dòng)操作，并消除潛在分析物/內(nèi)標(biāo)物的降解。

Payne等采用HPLC-FLD測(cè)定牛組織中的EPR。由于AVMs的熒光衍生試劑不太穩(wěn)定，在2h內(nèi)將損失50%，作者開發(fā)了-種自動(dòng)化的衍生化過(guò)程。在這一過(guò)程中，樣品提取液重新在甲基咪唑-乙腈溶液中再生，然后轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中供HPLC系統(tǒng)分析。在進(jìn)樣前利用自動(dòng)進(jìn)樣器的混合功能，再往進(jìn)樣瓶中加入適量TFAA充分混勻。該方法LOD為1ng/g，LOQ為2ng/g；回收率為87%～100%，CV小于13%。Flajs等在對(duì)奶和血漿中DOR殘留分析時(shí)，將干燥濃縮的提取物在室溫下加入100uL N-甲基咪唑的乙腈溶液(1+1，v/v)和150μL TFAA(1+2，v/v)進(jìn)行衍生化，再進(jìn)HPLC-FLD分析。色譜柱為Supelcosil LC-8-DB柱(150mm×4.6mm，5um)，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-水(470+470+60，v/v)，流速1.1mL/min，激發(fā)波長(zhǎng)364nm，發(fā)射波長(zhǎng)470nm。分析結(jié)果表明，奶中DOR的LOD為0.04ug/kg，CCa為0.1ug/kg，檢測(cè)能力(CCβ)為0.13ug/kg。Sutra等報(bào)道了檢測(cè)狗血漿中SEL的HPLC-FLD方法。提取物經(jīng)自動(dòng)SPE凈化后，用TFAA和N-甲基咪唑衍生，進(jìn)HPLC測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)355nm，發(fā)射波長(zhǎng)465nm。該方法LOD為0.1ng/mL。

Rupp等測(cè)定大西洋鮭魚肌肉組織中的IVM和DOR，提取物用C8和硅膠柱凈化后，用TFAA和N-甲基咪唑脫水處理，衍生形成熒光產(chǎn)物，該產(chǎn)物隨后用乙酸銨-甲醇溶液溶解轉(zhuǎn)換形成穩(wěn)定的醇形式，該反應(yīng)在50～55℃下需要15min。再用HPLC-FLD檢測(cè)，色譜柱為Hypersil C18柱，流動(dòng)相為乙腈-水(90+10，v/v)，柱溫65℃，激發(fā)波長(zhǎng)272nm，發(fā)射波長(zhǎng)465nm。IVM和DOR的回收率分別為75%～89%和73%～85%，RSD小于7%；LOD為0.25ppb。Knold等報(bào)道了采用乙腈提取，TFAA柱后衍生，AVM為內(nèi)標(biāo)，以HPLC-FLD法測(cè)定豬肝中的IVM和DOR。樣品用乙腈提取，上清液濃縮至近干，加110uL 1-甲基咪唑溶解，室溫反應(yīng)2min后，進(jìn)HPLC檢測(cè)。色譜柱為HypersilODS柱，水-乙腈(6+94，v/v)為流動(dòng)相，柱溫30℃，梯度洗脫，激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)470nm。添加濃度為15ug/kg時(shí)，IVM和DOR的回收率分別為75%和70%，LOD為0.8ug/kg，LOQ為1.6μg/kg。

Ali等采用HPLC-FLD測(cè)定牛肝臟中的AVM、IVM、DOR、EPR和MOX殘留時(shí)，AVM、IVM、DOR和MOX的衍生化產(chǎn)率瞬間可達(dá)到峰值，而EPR的產(chǎn)率則需要7h才能達(dá)到峰值。加熱到65℃，EPR反應(yīng)速度快，90min時(shí)產(chǎn)率最高，其他藥物的產(chǎn)率亦增加10%～15%。方法回收率大于70%，CV小于20%。侯曉林等采用HPLC分離，F(xiàn)LD檢測(cè)，建立了SPE分析牛組織中EPR、AVM、DOR和IVM殘留的方法。樣品用乙腈提取，堿性氧化鋁和C18柱凈化，用乙酸酐和1-甲基咪唑的乙腈溶液作衍生化試劑，在96℃條件下，完全衍生化需要100min。4種藥物的平均回收率為70.02%～88.75%，日內(nèi)CV小于8.52%，日間CV小于7.13%。EPR、AVM、DOR和IVM的LOD為0.4～0.5μg/kg，LOQ為2ug/kg。Roudaut等報(bào)道了檢測(cè)肝臟組織中AVM、IVM、DOR和MOX的HPLC方法。樣品用乙腈提取，C18柱凈化，TFAA衍生化后進(jìn)HPLC-FLD檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)361nm，發(fā)射波長(zhǎng)465nm。方法LOQ滿足歐盟的MRLs要求，回收率在77.5%～90.8%之間，RSD為2.7%～7.7%。Hou等檢測(cè)牛肝和牛肉中EPR、AVM、DOR和IVM殘留。樣品用乙腈提取，C18柱凈化，衍生化反應(yīng)后，用HPLC-FLD測(cè)定。牛肝中的回收率為70.31%～87.11%，牛肉為79.57%～93.65%，RSD分別小于17.84%和14.68%；方法LOD為0.5～1.0ng/g，LOQ為1～2ng/g。

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